Teknik Screening Tanaman Transgenik Putatif

     Screening merupakan langkah yang penting untuk mendapatkan tanaman transgenik. Metode yang digunakan untuk screening tanaman yang telah diintroduksikan gen tergantung dari tipe marker yang dipilih atau gen yang digunakan. Ketika gen tersebut resisten terhadap antibiotik maka digunakanlah marker tersebut. Screening dilakukan dengan cara melakukan kultur sel yang telah ditransformasikan pada medium yang mengandung antibiotik tertentu. Tanaman transgenik diketahui jika gen yang diinginkan terdeteksi.

    Southern blot technique digunakan untuk mendeteksi sekuens spesifik pada sampel DNA. Teknik ini juga dapat mengetahui jumlah salinan sekuens asing yang terintegrasi dalam genom. Prinsip dari prosedur ini adalah DNA dari tanaman didigesti dengan enzim restriksi yang memotong daerah tertentu. Fragmen terseparasi dalam elektroforesis gel agarosa dan tiap ukuran DNA yang telah terseparasi ditransfer ke membran dengan capillarity atau electric field. Membran diinkubasi dengan fragmen single strand DNA yang dapat hibridisasi dengan complementary DNA pada membran, kemudian nantinya dapat dideteksi dengan probe.

     Salah satu teknik untuk melihat hasil transformasi adalah teknik screening menggunakan Polymerase chain reaction (PCR), PCR digunakan untuk mengetahui adanya sekuens DNA spesifik pada gen target, atau penanda yang dipilih atau gen reporter dengan screening tanaman transgenik putatif menggunakan primer spesifik. PCR merupakan metode alternatif dan efisien untuk menentukan tanaman yang mengandung gen target secara akurat. Teknik ini seperti analisis Southern blot analysis, yang mana dapat mengestimasi jumlah salinan transgen yang terdapat dalam genom tumbuhan. PCR dapat membedakan antara tanaman yang mengandung satu dari dua transgen berbeda atau keduanya dalam satu uji. Vektor tanaman transformasi mengandung selectable marker gene, sehingga nantinya akan resisten terhadap antibiotik dan diketahui urutan DNAnya. Oligonukleotida dirancang sebagai marker vektor untuk diperiksa dengan PCR mengenai adanya penyisipan DNA asing di genom tumbuhan yang telah ditransformasikan. Primer yang sering digunakan untuk screening tanaman transgenik PCR adalah NPTII. Proses amplifikasi meliputi denaturasi DNA menjadi single strands, annealing primer pada strand DNA dan extension DNA yaitu memulai terjadinya polimerisasi. Selanjutnya molekul double strand DNA akan didenaturasi untuk memulai cycle yang baru. 

    Selain itu, Enzyme-linked Immunosorbent assay (ELISA) merupakan metode untuk mendeteksi adanya protein spesifik yang diproduksi dari transgen dalam tanaman hasil transformasi. Ekspresi dapat diuji secara kualitatif terhadap gen resisten antibiotik dan hebisida dengan metode in situ pada leaf paint bioassays dan juga secara kuantitatif menggunakan ELISA. Uji aktivitas enzim gen reporter dengan GUS system juga sering digunakan karena cocok untuk analisis tanaman transgenik. Kelemahan dari GUS system adalah tidak dapat digunakan untuk mengidentifikasi tanaman yang membawa transgen inaktif. Real-time Polymerase chain reaction (RT-PCR) digunakan ketika lebih dari satu gen perlu dianalisis menggunakan PCR, bersamaan dengan dengan mendeteksi jumlah salinan gen target. 

Referensi:

Clark, M. S. 2013. Plant Molecular Biology. Springer Science & Business Media. New York.Davey, M. R., dan Paul A. 2010. Plant Cell Culture. John Wiley & Sons. West Sussex.Kole, C., Charles M., Albert G. A., dan Timothy C. H. 2010. Transgenic Crop Plants. Springer Science & Business Media. New York.